Thời gian thực là gì? Các công bố khoa học về Thời gian thực

Bối cảnh: Hiện nay, vẫn chưa có sự thống nhất về cách thực hiện và diễn giải các thí nghiệm PCR định lượng thời gian thực (qPCR) tốt nhất. Vấn đề càng trở nên trầm trọng hơn do thiếu chi tiết thí nghiệm đầy đủ trong nhiều ấn phẩm, gây cản trở khả năng đánh giá phê bình chất lượng của các kết quả được trình bày hoặc thực hiện lại các thí nghiệm.

Nội dung: Hướng dẫn về Thông tin Tối thiểu cho Công bố Các Thí nghiệm PCR Thời gian thực Định lượng (MIQE) nhằm vào độ tin cậy của kết quả để giúp đảm bảo tính toàn vẹn của tài liệu khoa học, thúc đẩy sự nhất quán giữa các phòng thí nghiệm, và tăng cường tính minh bạch của thí nghiệm. MIQE là một tập hợp các hướng dẫn mô tả thông tin tối thiểu cần thiết cho việc đánh giá các thí nghiệm qPCR. Bao gồm là một danh sách kiểm tra đi kèm với sự gửi ban đầu của một bản thảo đến nhà xuất bản. Bằng cách cung cấp tất cả các điều kiện thí nghiệm và đặc điểm thử nghiệm liên quan, những người đánh giá có thể đánh giá tính hợp lệ của các giao thức đã sử dụng. Cần phải tiết lộ đầy đủ tất cả các thuốc thử, trình tự, và phương pháp phân tích để các nhà nghiên cứu khác có thể tái tạo kết quả. Chi tiết MIQE nên được công bố dưới dạng rút gọn hoặc như một phụ lục trực tuyến.

Tóm tắt: Việc tuân theo các hướng dẫn này sẽ khuyến khích thực hành thí nghiệm tốt hơn, cho phép diễn giải kết quả qPCR đáng tin cậy và rõ ràng hơn.

Bình thường hóa chính xác là điều kiện tiên quyết tuyệt đối để đo lường đúng biểu hiện gene. Đối với PCR sao chép ngược định lượng thời gian thực (RT-PCR), chiến lược bình thường hóa phổ biến nhất bao gồm tiêu chuẩn hóa một gene kiểm soát được biểu hiện liên tục. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, đã trở nên rõ ràng rằng không có gene nào được biểu hiện liên tục ở tất cả các loại tế bào và dưới mọi điều kiện thí nghiệm, ngụ ý rằng sự ổn định biểu hiện của gene kiểm soát dự kiến phải được xác minh trước mỗi thí nghiệm. Chúng tôi đã trình bày một chiến lược mới, sáng tạo và mạnh mẽ để xác định các gene được biểu hiện ổn định trong một tập hợp các gene ứng cử viên để bình thường hóa. Chiến lược này bắt nguồn từ một mô hình toán học về biểu hiện gene cho phép ước lượng không chỉ sự biến đổi tổng thể của các gene nghị biểu bình thường mà còn sự biến đổi giữa các nhóm mẫu bộ của tập hợp mẫu. Đáng chú ý, chiến lược này cung cấp một thước đo trực tiếp cho sự biến đổi biểu hiện ước tính, cho phép người dùng đánh giá lỗi hệ thống được tạo ra khi sử dụng gene này. Trong một so sánh trực tiếp với một chiến lược đã được công bố trước đó, cách tiếp cận dựa trên mô hình của chúng tôi có hiệu suất mạnh mẽ hơn và ít nhạy cảm hơn đối với điều chỉnh đồng biến của các gene bình thường hóa ứng cử viên. Chúng tôi đã sử dụng chiến lược dựa trên mô hình để xác định các gene phù hợp để bình thường hóa dữ liệu RT-PCR định lượng từ ung thư ruột kết và ung thư bàng quang. Các gene này bao gồm UBC, GAPD, và TPT1 cho ruột kết và HSPCB, TEGT, và ATP5B cho bàng quang. Chiến lược được trình bày có thể được áp dụng để đánh giá độ thích hợp của bất kỳ ứng cử viên gene bình thường hóa trong bất kỳ loại thiết kế thí nghiệm nào và nên cho phép bình thường hóa dữ liệu RT-PCR đáng tin cậy hơn.

Bài báo này trình bày một phương pháp tránh va chạm độc đáo theo thời gian thực cho các cơ khí manipulator và robot di động dựa trên khái niệm trường tiềm năng nhân tạo. Việc tránh va chạm, thường được coi là một vấn đề lập kế hoạch cấp cao, có thể được phân phối hiệu quả giữa các cấp độ điều khiển khác nhau, cho phép các hoạt động của robot trong môi trường phức tạp diễn ra theo thời gian thực. Phương pháp này đã được mở rộng cho các chướng ngại vật di động bằng cách sử dụng trường tiềm năng nhân tạo thay đổi theo thời gian. Chúng tôi đã áp dụng phương thức tránh va chạm này cho các cơ cấu robot tay và đã sử dụng một cách tiếp cận mới đối với vấn đề tổng quát về điều khiển manipulator theo thời gian thực. Chúng tôi đã tái cấu trúc vấn đề điều khiển manipulator như là điều khiển trực tiếp chuyển động của manipulator trong không gian thao tác—không gian mà nhiệm vụ được mô tả ban đầu—thay vì điều khiển chuyển động không gian khớp tương ứng của nhiệm vụ chỉ được đạt được sau khi biến đổi hình học và động học. Ngoài các khu vực ảnh hưởng của chướng ngại vật, chúng tôi đã khiến bộ phận cuối cùng di chuyển theo một đường thẳng với giới hạn tốc độ tối đa. Phương pháp trường tiềm năng nhân tạo đã được mở rộng để tránh va chạm cho tất cả các liên kết của manipulator. Thêm vào đó, một trường tiềm năng nhân tạo trong không gian khớp được sử dụng để thỏa mãn các ràng buộc khớp bên trong của manipulator. Phương pháp này đã được triển khai trong hệ thống COSMOS cho robot PUMA 560. Các thử nghiệm tránh va chạm thời gian thực trên các chướng ngại vật di động đã được thực hiện bằng cách sử dụng cảm biến hình ảnh.

Chúng tôi đã phát triển một phương pháp PCR định lượng "thời gian thực" mới. Phương pháp này đo sự tích lũy của sản phẩm PCR qua một đầu dò fluorogenic gắn nhãn kép (tức là, đầu dò TaqMan). Phương pháp này cung cấp phép đo định lượng số lượng bản sao gene rất chính xác và nghiêm ngặt. Không giống như các phương pháp PCR định lượng khác, PCR thời gian thực không yêu cầu xử lý mẫu sau PCR, ngăn ngừa sự lây nhiễm tiềm ẩn qua lại của sản phẩm PCR và dẫn đến các xét nghiệm nhanh hơn và hiệu suất cao hơn. Phương pháp PCR định lượng thời gian thực có một phạm vi động rất lớn trong việc xác định phân tử mục tiêu bắt đầu (ít nhất là năm bậc độ lớn). PCR định lượng thời gian thực cực kỳ chính xác và ít tốn công sức hơn các phương pháp PCR định lượng hiện tại.

Bài viết này mô tả sự phát triển mới nhất của một cách tiếp cận tổng quát để phát hiện và hình dung các xu hướng nổi bật và các kiểu tạm thời trong văn học khoa học. Công trình này đóng góp đáng kể về lý thuyết và phương pháp luận cho việc hình dung các lĩnh vực tri thức tiến bộ. Một đặc điểm là chuyên ngành được khái niệm hóa và hình dung như một sự đối ngẫu theo thời gian giữa hai khái niệm cơ bản trong khoa học thông tin: các mặt trận nghiên cứu và nền tảng trí tuệ. Một mặt trận nghiên cứu được định nghĩa như một nhóm nổi bật và nhất thời của các khái niệm và các vấn đề nghiên cứu nền tảng. Nền tảng trí tuệ của một mặt trận nghiên cứu là dấu chân trích dẫn và đồng trích dẫn của nó trong văn học khoa học—một mạng lưới phát triển của các ấn phẩm khoa học được trích dẫn bởi các khái niệm mặt trận nghiên cứu. Thuật toán phát hiện bùng nổ của Kleinberg (2002) được điều chỉnh để nhận dạng các khái niệm mặt trận nghiên cứu nổi bật. Thước đo độ trung gian của Freeman (1979) được sử dụng để làm nổi bật các điểm chuyển đổi tiềm năng như các điểm chịu ảnh hưởng nền tảng trong thời gian. Hai quan điểm hình dung bổ sung được thiết kế và thực hiện: các quan điểm cụm và các quan điểm vùng thời gian. Những đóng góp của phương pháp là (a) bản chất của một nền tảng trí tuệ được nhận diện bằng thuật toán và theo thời gian bởi các thuật ngữ mặt trận nghiên cứu nổi bật, (b) giá trị của một cụm đồng trích dẫn được diễn giải rõ ràng theo các khái niệm mặt trận nghiên cứu, và (c) các điểm chịu ảnh hưởng nổi bật và được phát hiện bằng thuật toán giảm đáng kể độ phức tạp của một mạng lưới đã được hình dung. Quá trình mô hình hóa và hình dung được thực hiện trong CiteSpace II, một ứng dụng Java, và áp dụng vào phân tích hai lĩnh vực nghiên cứu: tuyệt chủng hàng loạt (1981–2004) và khủng bố (1990–2003). Các xu hướng nổi bật và các điểm chịu ảnh hưởng trong mạng lưới được hình dung đã được xác minh phối hợp với các chuyên gia trong lĩnh vực, là tác giả của các bài báo chịu ảnh hưởng. Các ngụ ý thực tiễn của công trình được thảo luận. Một số thách thức và cơ hội cho các nghiên cứu sau này được xác định.

Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) là phương pháp nhạy nhất để phát hiện mRNA với số lượng thấp, thường thu được từ các mẫu mô hạn chế. Tuy nhiên, đây là một kỹ thuật phức tạp, có nhiều vấn đề đáng kể liên quan đến độ nhạy, tính tái sản xuất và tính đặc hiệu của nó, và với tư cách là một phương pháp định lượng, nó gặp phải những vấn đề vốn có trong PCR. Sự ra đời gần đây của các quy trình RT-PCR động học dựa trên huỳnh quang đã đơn giản hóa đáng kể quá trình tạo ra sự định lượng mRNA tái sản xuất và hứa hẹn sẽ khắc phục những hạn chế này. Tuy nhiên, việc áp dụng thành công của chúng phụ thuộc vào sự hiểu biết rõ ràng về các vấn đề thực tiễn, và thiết kế thí nghiệm, ứng dụng và xác thực cẩn thận vẫn là điều cần thiết để đo lường định lượng chính xác sự phiên mã. Bài đánh giá này thảo luận về các khía cạnh kỹ thuật liên quan, tương phản giữa các phương pháp RT-PCR thông thường và động học trong việc định lượng biểu hiện gen và so sánh các hệ thống RT-PCR động học khác nhau. Nó minh họa sự hữu ích của những xét nghiệm này bằng cách chứng minh sự khác biệt đáng kể về mức độ phiên mã giữa các cá thể trong họ gen housekeeping, dehydrogenase glyceraldehyde-3-phosphate (GAPDH).

Phương pháp PCR Ngược Dòng Thời gian Thực dựa trên huỳnh quang (RT-PCR) được sử dụng rộng rãi để định lượng mức mRNA ở trạng thái ổn định và là một công cụ quan trọng cho nghiên cứu cơ bản, y học phân tử và công nghệ sinh học. Các thử nghiệm dễ tiến hành, có khả năng xử lý khối lượng lớn, và có thể kết hợp độ nhạy cao với độ đặc hiệu đáng tin cậy. Công nghệ này đang tiến hóa nhanh chóng với sự xuất hiện của các enzym, hóa chất và thiết bị mới. Tuy nhiên, mặc dù RT-PCR thời gian thực đã giải quyết nhiều khó khăn vốn có trong RT-PCR thông thường, nó đã trở nên ngày càng rõ ràng rằng nó tạo ra những vấn đề mới cần giải quyết cấp thiết. Do đó, bên cạnh việc cung cấp bức tranh tổng thể về công nghệ RT-PCR thời gian thực, bài đánh giá này còn có mục tiêu bổ sung: sẽ mô tả và thảo luận cụ thể một số vấn đề liên quan đến việc giải thích các kết quả có tính chất số học và dễ dàng phân tích thống kê, nhưng độ chính xác của chúng bị ảnh hưởng đáng kể bởi sự biến đổi của hóa chất và người điều hành.

Một phương pháp xét nghiệm PCR phát huỳnh quang (TaqMan) đã được phát triển để phát hiện các dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum. Hai đầu dò phát huỳnh quang đã được sử dụng trong một phản ứng đa mã: một đầu dò RS có phạm vi rộng để phát hiện tất cả các biovar của R. solanacearum và một đầu dò B2 đặc hiệu hơn để phát hiện chỉ biovar 2A. Quá trình khuếch đại mục tiêu được đo lường thông qua hoạt động nuclease tại 5′ của Taq DNA polymerase trên từng đầu dò, dẫn đến phát xạ huỳnh quang. PCR TaqMan đã được thực hiện với DNA chiết xuất từ 42 dòng R. solanacearum và các dòng có liên quan về mặt di truyền hoặc huyết thanh học để chứng minh tính đặc thù của xét nghiệm. Trong các môi trường nuôi cấy tinh khiết, R. solanacearum có thể được phát hiện ở mức độ ≥10² tế bào ml⁻¹. Độ nhạy giảm khi xét nghiệm PCR TaqMan được thực hiện với các chiết xuất từ mô khoai tây được tiêm chủng, chuẩn bị theo các quy trình chiết xuất hiện được khuyến cáo. Một đầu dò phát huỳnh quang thứ ba (COX), được thiết kế sử dụng trình tự gen cytochrome oxidase của khoai tây, cũng đã được phát triển để sử dụng như một kiểm soát nội bộ PCR và đã được chứng minh để phát hiện DNA khoai tây trong PCR TaqMan multiplex RS-COX với mô khoai tây bị nhiễm. Tính đặc thù và độ nhạy của xét nghiệm, kết hợp với tốc độ cao, bền bỉ, độ tin cậy và khả năng tự động hóa, mang lại những lợi thế tiềm năng trong việc định danh thường kỳ của củ khoai tây và các vật liệu thực vật khác nhằm phát hiện sự hiện diện của R. solanacearum.